OA1 review

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Initial position: 4 ottobre 2007
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Albinismo Oculare di tipo 1

L’Albinismo Oculare è un tipo di Albinismo caratterizzato da ipomelanosi oculare, cui sono associate specifiche anomalie del sistema ottico.

L’Albinismo oculare di tipo 1 (OA1), noto anche come OA di tipo Nettleship-Falls,  è la forma più comune; le altre, meno comuni, rientrano nell’ambito dell’Albinismo oculocutaneo, soprattutto OCA1 e OCA2.

Si tratta di una condizione genetica, ereditata in modo recessivo X-linked, con maschi affetti, che mostrano il fenotipo completo, e femmine portatrici, che possono mostrare minimi segni cutanei ed oculari .

 Il fenotipo OA1

I maschi affetti presentano il fenotipo oftalmologico, tipico di tutte le forme di Albinismo: ipoplasia della fovea e severa riduzione dell’acuità visiva, riduzione della componente ipsolaterale dei tratti ottici e perdita della visione stereoscopica, depigmentazione dell’epitelio pigmentato della retina (RPE), trasparenza dell’iride e fotofobia, nistagmo e strabismo.

Il fenotipo cutaneo (pigmentazione di cute e capelli) risulta, generalmente, normale. E’ possibile notare una leggera ipopigmentazione, solo se i maschi affetti vengono messi a confronto con i membri non affetti della stessa fratria.

Le femmine portatrici, eterozigoti obbligate, possono essere individuate clinicamente, nell’80-90% dei casi, per la presenza di una pigmentazione a mosaico dell’epitelio pigmentato della retina e di aree punteggiate di trasparenza dell’iride, fenomeni che suggeriscono un’inattivazione random dell’ X. Poche femmine risultano affette, mostrando i cambiamenti oculari tipici, probabilmente come risultato di una inattivazione non random dell’X o omozigosità allelica recessiva della mutazione genica in questione o parziale monosomia del cromosoma X.

L’analisi istologica dei melanociti, sia cutanei che dell’epitelio pigmentato della retina, nei maschi affetti, rivela la presenza di melanosomi giganti, detti macromelanosomi (MMGs), accanto a melanosomi normali. Questi grossi granuli di pigmento possono mancare nei maschi affetti, mentre possono riscontrarsi nelle femmine portatrici. Rappresentano un elemento diagnostico aggiuntivo. La loro presenza suggerisce un difetto nella biogenesi dei melanosomi.

 Il gene OA1

Il locus per OA1 è stato assegnato alla regione Xp22.3,  mediante analisi di linkage  e mappe di delezione. Il gene OA1 è stato isolato mediante un approccio di clonaggio posizionale. Occupa circa 40 kb del DNA genomico e comprende 9 esoni.

L’analisi per Northern blotting di campioni di poli(A)+RNA, estratti da tessuti adulti e fetali, indica che il trascritto OA1 è espresso, ad alti livelli, esclusivamente nella retina e nel melanoma cutaneo (un tessuto altamente pigmentato), in accordo con il fenotipo clinico riscontrato in tale condizione genetica.

L’ortologo murino, Oa1, presenta lo stesso modello di espressione (nei melanociti cutanei e retinici) e l’80% circa di somiglianze a livello proteico.

Utilizzando l’RT-PCR e l’ibridazione in situ (sia wholemount che su sezioni adiacenti di tessuto), è stato eseguito il monitoraggio temporale e spaziale dellespressione del gene Oa1, durante lo sviluppo dell’occhio, dallo stadio E9.5, quando la vescicola ottica comincia a formarsi, allo stadio adulto. L’uso di teste ed occhi, dissezionati da topi embrionali ed adulti, preclude, per ovvi motivi, lo stesso tipo di analisi nell’uomo.

L’espressione di Oa1 comincia allo stadio E10.5, prima della deposizione del pigmento melanico (E11.5), nella parte dorsale dello strato esterno della coppa ottica, destinato a divenire epitelio pigmentato della retina (RPE). Allo stadio E11.5 la sua espressione si estende a tutte le cellule dello strato esterno della coppa ottica e, allo stadio E18.5, arriva al corpo ciliare. Allo stadio P0 i suoi trascritti sono ancora presenti e si mantengono nell’adulto.

A cominciare, inoltre, dallo stadio E16.5, i suoi trascritti si trovano anche nei melanociti derivati dalla cresta neurale, che vanno a localizzarsi nella cute, nei follicoli piliferi e nell’orecchio interno.

Questo pattern di espressione temporale e spaziale è molto simile a quello mostrato da altri due geni coinvolti nella pigmentazione, Tyr e p, il che viene spiegato dalla presenza di un comune fattore di controllo della trascrizione, Mitf, che, legandosi ad uno determinato E-box (CATGTG), regola l’espressione tessuto-specifica sia di geni coinvolti nella sintesi della melanina che di quelli coinvolti nella biogenesi dei melanosomi ( dati in vitro e in vivo).

Sembra che dalla retina centrale dorsale, dove comincia l’espressione di Oa1, Tyr e p, si generino le prime cellule gangliari retiniche i cui assoni si proiettano ipsolateralmente, fungendo da pionieri della via ipsolaterale. Potrebbe essere un indizio atto a chiarire la presenza della decussazione anomala delle fibre nervose della retina temporale a livello del chiasma ottico. I pareri sono comunque, al momento, discordanti.

 

 

La proteina OA1

L’analisi della sequenza nucleotidica del DNA complementare (cDNA) del gene OA1 conduce ad una probabile struttura primaria per la proteina OA1, che conta 404 amminoacidi, a partire dal secondo ATG in-frame, ed il cui profilo di idrofobicità indica la presenza di diversi domini transmembrana.

La proteina endogena OA1 è stata individuata, mediante Western immunoblotting, negli estratti proteici di cellule umane dell’epitelio pigmentato della retina (RPE), melanociti umani normali e cellule del melanoma umano, ma non nelle cellule COS-7 e nelle cellule HeLa, in conformità con quanto mostrato dai dati di espressione dell’mRNA. Essa si presenta sotto forma di una banda di 60 kDa e di un doppietto di 45 e 48 kDa.

La digestione degli estratti proteici con N-glicosidasi F, determina la scomparsa della banda di 60 kDa, mentre risulta più intenso il segnale corrispondente alle bande di 45 e 48 kDa. Questo sta ad indicare che la banda di 60 kDa è una proteina glicosilata e le bande di 45 e 48 kDa rappresentano i precursori peptidici non glicosilati. La presenza delle bande di 45 e 48 kDa nelle cellule COS-7 ed HeLa transfettate con vettori di espressione per OA1 e la loro assenza negli estratti proteici dei melanociti provenienti da pazienti OA1, confermano che è stato identificato il prodotto del gene OA1.

Ulteriori studi stabiliscono che la banda di 45 kDa rappresenta la proteina backbone, la banda di 48 kDa rappresenta la forma che ha subito una modificazione post-traduzionale non ancora nota e la banda di 60 kDa rappresenta la forma glicosilata di entrambe le specie proteiche.

N106, localizzato nel primo loop luminale (e1), è l’unico sito di glicosilazione.

I patterns di glicosilazione, mostrati dalla proteina endogena OA1 nei melanociti umani normali e dalla proteina OA1 selvatica espressa nelle cellule COS-7 mediante vettori pRc/RSV, in seguito ad analisi Western immunoblotting dei rispettivi estratti proteici, in assenza o in presenza di deossimannoirimicina, che blocca la glicosilazione N-linked nell’Apparato del Golgi, o tunicamicina ( solo per le cellule COS-7, perché molto tossica per i melanociti), che blocca la glicosilazione N-linked nel Reticolo Endoplasmatico (ER), o N-glicosidasi F, indicano che la proteina OA1 endogena nei melanociti e la proteina OA1 ricombinante nelle cellule COS-7, seguono una via di processamento simile, con una tappa nel Reticolo Endoplasmatico e una nel Golgi, come altre proteine melanosomali ( tirosinasi e TRP-1). Da notare che nelle cellule COS-7 transfettate solo una piccola quantità della proteina OA1 si presenta nella forma completamente glicosilata, la banda di 60 kDa, ed una notevole quantità rimane nella forma parzialmente glicosilata, la banda di 51 kDa ( indicata come tale dal trattamento con tunicamicina), probabilmente a causa degli alti livelli di espressione ottenuti dall’utilizzo di vettori pRc/RSV (il promotore RSV è molto forte) e/o per l’assenza di una via di glicosilazione, specifica per le cellule melanocitiche. Si notano infatti altre bande, indicative di una glicosilazione anomala.

Il frazionamento subcellulare di melanociti umani normali mostra che la proteina OA1 è localizzata nella frazione ricca di melanosomi (LGF).

La migrazione della proteina OA1 nella fase detergente, in seguito a solubilizzazione in Triton X-114 e successiva separazione di fase, indica che il suo comportamento è quello tipico di una vera e propria proteina di membrana integrale, come suggerito dall’analisi del profilo di idrofobicità eseguita sulla prevista sequenza amminoacidica.

Analisi di immunofluorescenza e di immunogold su melanociti umani normali assegnano chiaramente la proteina OA1 alla membrana melanosomale, in tutti gli stadi di maturazione del melanosoma (stadi I-IV), ma non alla membrana plasmatica.

Il prodotto del gene OA1 è dunque una glicoproteina di membrana integrale, specifica delle  cellule pigmentate, localizzata a livello della membrana melanosomale.

Risultati simili sono stati ottenuti per la proteina murina Oa1, che conta 405 aa e si presenta come un doppietto di 44-46 kDa (le forme non glicosilate) e ed una banda di 48 kDa (la forma glicosilata).

 

     OA1p: caratteristiche strutturali e funzionali tipiche di un GPCR

L’uso di strumenti bioinformatici più sofisticati (programma PHDhtm; algoritmi Blast2 e FastA ) consente di rilevare somiglianze ed omologie di sequenza, prima non evidenziate, tra la proteina OA1 e i membri delle famiglie A, B ed E della superfamiglia GPCR, che comprende recettori coinvolti nel più comune sistema di trasduzione del segnale a livello della membrana plasmatica, basato sull’accoppiamento-attivazione di una proteina G eterotrimerica, in risposta al legame con un agonista.

La proteina OA1 si presenta come un recettore a serpentina, con 7 domini transmembrana idrofobici ad alfa-elica (TMI-VII), 3 loops idrofilici luminali/extracellulari (e1-3) e 3 loops idrofilici citoplasmatici/intracellulari (i1-3), e contiene diversi residui, altamente conservati nella maggior parte dei GPCRs, molti dei quali svolgono un ruolo critico nell’assunzione di una comune struttura tridimensionale in questi recettori e risultano mutati in pazienti OA1, a prova della loro criticità anche in questa proteina. Queste due caratteristiche sono tipiche dei GPCRs, quindi altamente significative nella valutazione della tipologia della proteina OA1.

Per testare la capacità della proteina OA1 di legare proteine G, l’immunoprecipitato contenente la proteina OA1 endogena, ottenuto da estratti proteici di melanociti umani normali , è stato sottoposto a Western  immunoblotting con specifici anticorpi contro diverse subunità delle proteine G. Da tale analisi risulta che la proteina OA1 co-immunoprecipita con le subunità Gβ, Gαi e Gαo delle proteine G. Lo stesso tipo di analisi è stato eseguito su immunoprecipitati contenenti la proteina OA1 selvatica e proteine OA1 mutate, ottenuti rispettivamente da estratti di cellule COS-7 transfettate con vettori di espressione per il gene OA1 selvatico e per geni OA1 mutati. La proteina OA1 selvatica (OA1p WT), espressa nelle cellule COS-7, co-immunoprecipita con le subunità Gβe Gαi, confermando i dati ottenuti con la proteina OA1 endogena espressa nei melanociti umani normali. Al contrario le proteine OA1 mutate (D78N in TM2 e C116S in e1), espresse nelle cellule COS-7, interagiscono poco o affatto con le suddette subunità, indicando che l’interazione tra la proteina OA1 e la proteina G è specifica, in quanto viene a mancare in presenza di mutazioni missenso a carico di residui amminoacidici altamente conservati, critici quindi per la struttura/funzione della proteina OA1, così come già rilevato per i canonici GPCRs.

Le analisi di legame in vitro OA1p-Gp di estratti di melanociti umani normali incubati con proteine ricombinanti, corrispondenti al terzo loop intracellulare (GST-i3) e alla coda carbossi-terminale (6xHis-CT) della proteina OA1, due regioni che nei canonici GPCRs sono coinvolte nel legame con la proteina G, mostrano l’interazione con le subunità suddette, ma non con altre proteine, presenti in elevata quantità, quali γ-adaptina, tirosinasi e vimentina., a conferma dei dati di co-immunoprecipitazione e indicativi dei siti coinvolti nel legame OA1p-Gp.

La biotinilazione in vivo della superficie cellulare di melanociti umani normali, seguita da immunoprecipitazione con un anticorpo anti-OA1p, indica l’assenza della proteina OA1 sulla membrana plasmatica, confermando i dati precedentemente forniti da studi di immunofluorescenza e di immunogold, che assegnano alla proteina OA1 una localizzazione melanosomale, diversamente dagli altri membri della superfamiglia GPCR, tutti localizzati sulla membrana plasmatica .La proteina OA1 è dunque il primo esempio di GPCR esclusivamente intracellulare, a sostegno dell’ipotesi, formulata in seguito al riscontro di una notevole distribuzione delle proteine G nelle membrane interne, in base alla quale sistemi di trasduzione del segnale mediati da GPCRs operano anche a livello delle membrane interne nelle cellule dei mammiferi.

Pareri contrastanti esistono circa la precisa localizzazione subcellulare della proteina OA1, dovuti probabilmente alle diverse tecniche usate. Sembra, dai dati più recenti, che la proteina OA1 sia distribuita sia lungo i compartimenti endosomali tardivi/lisosomali che lungo i compartimenti melanosomali.

L’analisi di immunofluorescenza mostra inoltre che la proteina OA1 non viene smistata alla membrana plasmatica, neppure nelle cellule non melanocitiche, quali le cellule COS-7 transfettate con vettori di espressione per OA1, dove si co-localizza con marcatori lisosomali (DAMP e catepsina), indicando che OA1p segue la via di smistamento lisosomale/melanosomale come altre proteine melanosomali (tirosinasi, TRP-1), a sostegno dell’esistenza di una via biogenetica lisosomale/melanosomale, con una tappa endosomale comune.

Anche la proteina G che interagisce con la proteina OA1 ha una localizzazione melanosomale, come dimostrato dalla co-localizzazione  melanosomale di OA1p, Gβ e Gαi in criosezioni ultrasottili di melanociti umani normali sottoposte ad immunogold a doppia colorazione. In particolare la tecnica di colorazione con immunoperossidasi a livello ultrastrutturale identifica nel lato citoplasmatico della membrana melanosomale gli epitopi riconosciuti dagli anticorpi anti-OA1 (anti-CT), anti-Gβ e anti-Gαi , indicando che il recettore OA1 è inserito nella membrana melanosomale/lisosomale con l’estremità carbossiterminale rivolta verso il citoplasma e l’estremità amminoterminale rivolta verso il lume melanosomale. Rispecchiando in tal modo quello che è l’orientamento topologico dei GPCRs nelle membrane plasmatiche (estremità carbossiterminale rivolta verso il citoplasma ed estremità amminoterminale rivolta verso l’ambiente extracellulare), è probabile la presenza di un ligando nel lume intramelanosomale.

 Funzione del recettore OA1

La presenza di macromelanosomi nei melanociti cutanei e retinici dei pazienti OAI è il primo indizio a supporto di un possibile ruolo della proteina OA1 nella biogenesi dei melanosomi.

Una volta attivato da un ligando intramelanosomale, il recettore OA1 potrebbe innescare un segnale di trasduzione a cascata, attraverso l’attivazione di proteine G, sul lato citoplasmatico della membrana melanosomale, controllando processi implicati nella biogenesi dei melanosomi, quali l’attività di altre proteine melanosomali (proteina P, tirosinasi), e/o il traffico di vescicole verso i melanosomi, e/o il movimento dei melanosomi lungo il citoscheletro, e/o l’interazione con altri effettori sconosciuti.

Il ligando intramelanosomale, in grado di attivare il recettore OA1, potrebbe essere rappresentato dalla stessa melanina o da precursori e prodotti intermedi della melanina, se non addirittura dall’allargamento dell’organello, che, in assenza del segnale della proteina OA1, potrebbe portare alla formazione del macromelanosoma. Nulla esclude, però, che la proteina OA1 si comporti come un recettore costitutivamente attivo e che, quindi, il suo ligando agisca come un agonista inverso o inibitore.

La via a valle, innescata dall’accoppiamento-attivazione OA1p-Gp, rimane un mistero.

L’assenza, comunque, dell’attività del recettore OA1 e del conseguente segnale di innesco di una via citoplasmatica a valle, produce serie implicazioni a livello melanosomale. Il legame tra la proteina OA1 non funzionante e l’ alterazione delle dimensioni melanosomali è confermato dal modello murino dell’Albinismo Oculare, rappresentato da topi maschi emizigoti Oa1-/Y, animali transgenici creati a partire da cellule staminali embrionali (ES) della linea AB2.2, selezionate positivamente per il genotipo Oa1 nullo, in seguito ad elettroporazione di una coltura delle stesse, in presenza di un vettore targeting in cui il primo esone del gene Oa1 viene sostituito da una cassetta di espressione PGK-hprt.

Questi topi Oa1 Knockout (Oa1 KO), che mostrano le caratteristiche fenotipiche dei pazienti OA1, ossia ipopigmentazione del fondo oculare, percorso anomalo delle fibre retinofugali e macromelanosomi nell’epitelio pigmentato della retina, sono un valido strumento per lo studio della patogenesi dell’Albinismo Oculare e della biogenesi dei macromelanosomi, attraverso l’analisi ultrastrutturale dell’epitelio pigmentato della retina nel corso dello sviluppo, chiaramente non attuabile nell’uomo (Esiste un unico articolo, pubblicato nel 1983, in cui viene descritta l’istologia dell’epitelio pigmentato della retina in un feto maschio umano di 21 settimane affetto da OA1).

Dallo stadio E11.5 allo stadio E17.5 nell’epitelio pigmentato della retina dei topi Oa1 -/Y ci sono melanosomi simili a quelli presenti nei topi selvatici, per numero, struttura, grado di maturazione e dimensioni. Allo stadio P1 compaiono, accanto a melanosomi normali, i primi macromelanosomi ed il loro numero aumenta progressivamente fino all’età adulta, quando la maggior parte dei melanosomi mostra un fenotipo gigante. Il diametro medio dei macromelanosomi è circa tre volte il diametro dei melanosomi normali ( 18.8 µm contro i 4.6 µm).

La presenza di un singolo core melanosomale all’interno dei macromelanosomi, il numero totale di melanosomi pigmentati maturi per cellula, invariato fino allo stadio P7 e leggermente ridotto nell’adulto, e l’assenza di intermedi di fusione melanosoma-melanosoma, suggeriscono che i macromelanosomi derivino dalla crescita anomala di singoli organelli, piuttosto che dalla fusione di melanosomi normali. Gli organelli, incapaci di controllare le loro dimensioni finali, continuerebbero a crescere in modo smisurato. Il recettore Oa1 potrebbe avere un ruolo inibitorio in una delle tappe finali della maturazione melanosomale, regolando l’afflusso delle risorse (enzimi, membrane, melanina, precursori), assegnate allo sviluppo dei melanosomi: con la sua attività di controllo determinerebbe una progressiva riduzione dell’afflusso delle risorse ai melanosomi maturi, che in tal modo conserverebbero le loro normali dimensioni, e favorirebbe lo sviluppo di nuovi melanosomi.

La probabilità che la melanina sia il ligando del recettore OA1 potrebbe in qualche modo spiegare le anomalie di sviluppo del sistema visivo, presenti in tutti i tipi di Albinismo, sia essi caratterizzati da un difetto a livello della melanogenesi (OCA), che a livello della melanosomalogenesi (OA).

Venendo a mancare nell’uno la melanina, nell’altro il recettore OA1 funzionante, verrebbe, in entrambi i casi, a mancare l’attività del recettore OA1 e di conseguenza il segnale citoplasmatico, deputato, in un qualche modo, al controllo dello sviluppo del sistema ottico.

Si tenga presente inoltre che i macromelanosomi, che compaiono solo allo stadio P1, non possono essere considerati un effetto causativo diretto delle anomalie del sistema visivo, in particolare della decussazione anomala delle fibre ottiche retiniche a livello del chiasma, in quanto sono assenti, almeno nei topi, quando, allo stadio E12.5, i primi assoni retinici entrano nella regione chiasmatica e più tardi, quando, allo stadio E16, sono presenti sia gli assoni incrociati che quelli non incrociati.

In alternativa, poiché la formazione di macromelanosomi richiede membrane extra, il recettore OA1 potrebbe regolare il traffico di membrane dagli endosomi tardivi ai melanosomi maturi. In sua assenza, si formerebbero macromelanosomi in seguito ad un continuo allargamento di compartimenti endosomali tardivi o ad un continuo traffico di vescicole verso i melanosomi maturi . Questa ipotesi spiegherebbe perché il fenotipo macromelanosomale è meno severo nei melanociti cutanei che in quelli retinici. L’epitelio pigmentato della retina è coinvolto in una continua fagocitosi e degradazione dei segmenti più esterni dei fotorecettori, per cui necessita di meccanismi efficaci per segregare lisosomi dagli organelli adiacenti.

 

 Patogenesi molecolare di OA1

Ai topi Oa1 KO, come strumento di indagine sulla patogenesi dell’Albinismo oculare, si è aggiunto lo studio in vitro di 19 diverse mutazioni missenso, corrispondenti essenzialmente allo spettro completo di mutazioni missenso identificate finora nei pazienti con questo disordine, sparse lungo la proteina OA1, fatta eccezione per la coda carbossiterminale.

Poiché i patterns di immunoblotting e di immunofluorescenza, mostrano che la proteina OA1 endogena nei melanociti e la proteina OA1 WT nelle cellule COS-7 seguono vie di processamento e di smistamento simili, lo studio è stato basato sull’analisi del comportamento, in tali processi biochimici, di 19 proteine OA1 mutanti espresse nelle cellule COS-7 (corrispondenti ad altrettante mutazioni missenso), rispetto alla proteina OAI selvatica espressa nello stesso tipo cellulare. In un solo caso si è avuta la possibilità di condurre lo stesso tipo di analisi su una proteina OA1 mutante endogena espressa in colture di melanociti ottenuti dalla biopsia cutanea di un paziente.

Le 19 diverse mutazioni missenso sono state introdotte in OA1 cDNAs, mediante mutagenesi in vitro sito-diretta. I risultanti cDNAs mutanti sono stati subclonati in vettori di espressione pRc/RSV, utilizzati, a loro volta, per transfettare, mediante elettroporazione, cellule COS-7.  Lo studio ha rivelato due comportamenti alternativi , rispetto al processamento e allo smistamento , che hanno condotto alla suddivisione delle proteine mutanti e delle corrispondenti mutazioni in due gruppi.

Le proteine OA1 mutanti del gruppo I (8/19 mutazioni pari al 40%) mostrano patterns di immunoblotting e di immunofluorescenza completamente sovrapponibili a quelli della proteina OA1 selvatica, quando espresse nelle cellule COS-7. Il pattern di immunoblotting mostra che la glicosilazione è completa, data la presenza di bande di 45, 51 e 60 kDa ed il pattern di immunofluorescenza mostra una distribuzione vescicolare citoplasmatica, più concentrata nell’area perinucleare e sparsa verso la periferia, cioè una localizzazione subcellulare lisosomale, testimoniata dalla co-localizzazione con marcatori lisosomali. La maggior parte (6/8) di queste mutazioni è localizzata all’interno o molto vicino ai loops intracellulari i2 e i3, due regioni che nei canonici GPCRs giocano un ruolo particolarmente critico nel segnale a valle. Questi dati suggeriscono che le mutazioni del gruppo II potrebbero determinare la sostituzione di residui amminoacidici aventi un ruolo funzionale nell’attività di segnale della proteina OA1 come GPCR.

Ne segue che i loops i2 e i3 dovrebbero rappresentare importanti domini funzionali nella proteina OA1, come lo sono nei canonici GPCRs, e che il fenotipo OA1 dovrebbe presumibilmente risultare dalla mancanza del meccanismo di funzione della proteina OA1. Ci sono comunque esperimenti che mostrano differenze non apprezzabili, nella capacità di legare la proteina G, tra le proteine OA1 mutanti e la proteina OA1 selvatica, per cui sarebbe ancora da definire quale sia il difetto biochimico, determinato dalle mutazioni del gruppo I, a carico dell’attività di segnale del recettore OA1 in risposta al legame con il ligando.

Le proteine OA1 mutanti del gruppo II (11/19 mutazioni pari al 60%) mostrano un pattern di glicosilazione alterato, rispetto alla proteina selvatica, caratterizzato dalla presenza di bande di 45 e di 51 kDa e dall’assenza della banda di 60 kDa. Il pattern di bande risulta identico sia nelle cellule non trattate che in quelle trattate con deossimannoirimicina  e si riduce alla sola banda di 45 kDa nelle cellule trattate con tunicamicina, a  prova dell’assenza della tappa di processamento golgiana. Anche il pattern di immunofluorescenza risulta alterato, caratterizzato da una distribuzione reticolare, con una colorazione pesante della membrana nucleare, coerente con l’accumulo delle proteine nel Reticolo Endoplasmatico. Le mutazioni che appartengono a questo gruppo sono fondamentalmente localizzate all’interno o vicino ai domini transmembrana e riguardano residui altamente conservati nella maggior parte dei GPCRs importanti per l’impacchettamento delle alfa eliche idrofobiche e quindi per la struttura della proteina. Si presume che, anche nel caso della proteina OAI, come negli altri GPCRs,  i residui interessati abbiano un ruolo strutturale ed interferiscano quindi con il corretto ripiegamento della proteina e l’inserzione della proteina attraverso la membrana , con conseguente ritenzione della proteina nel Reticolo Endoplasmatico, senza completamento della glicosilazione nel Golgi né raggiungimento della localizzazione finale nei lisosomi. La proteina così mal ripiegata sosterebbe nel Reticolo Endoplasmatico, dove, sottoposta al controllo di qualità, verrebbe degradata. Indizio dell’avvenuta degradazione dovrebbe essere la diminuzione del prodotto, che non appare, però, quando la proteina è espressa nelle cellule COS-7 mediante vettori pRc/RSV, o  perché  il promotore RSV determina la produzione di grandi quantità delle proteine ricombinanti nelle cellule transfettate o perché, non essendo le cellule COS-7 il tipo cellulare endogeno per OA1, manca un efficiente meccanismo di degradazione per questa proteina.

Utilizzando il vettore retrovirale LXSN, provvisto di un promotore debole, per esprimere la forma selvatica e le forme mutanti della proteina OA1 nelle cellule COS-7 si è venuti a capo di questa questione. L’analisi western immunoblotting mostra che la proteina OA1 selvatica e le proteine OAI mutanti del gruppo I sono prodotte come bande di 45 e 60 kDa, con nessun accumulo della banda di 51 kDa rappresentativa della forma parzialmente glicosilata, mentre le proteine mutanti del gruppo II non solo mostrano l’assenza della banda di 60 kDa, come atteso, ma anche una significativa riduzione o assenza della banda di 45 kDa, con un pattern addirittura appena distinguibile da quello ottenuto con il vettore LXSN vuoto. Questi dati indicano chiaramente che le proteine OAI del gruppo II sono presenti in quantità ridotte, a volte addirittura assenti, questo a prova della degradazione cui vanno incontro, una volta bloccate nel Reticolo Endoplasmatico. Il fenotipo OA1 sarebbe in questo caso prodotto dalla mancanza o dalla notevole riduzione della proteina OA1, che, trattenuta nel Reticolo Endoplasmatico, in quanto mal ripiegata, verrebbe ben presto degradata.

 Quanto detto è confermato dall’analisi dei melanociti isolati da un paziente che porta la mutazione D78N. Sebbene sia l’unico paziente con una mutazione missenso dal quale si sia ottenuta una biopsia cutanea, la mancanza della proteina OA1 D78N mutante nei suoi melanociti coltivati, suggerisce fortemente che lo stesso debba accadere per le altre proteine mutanti del gruppo II, quando espresse endogenamente in vivo.

Studi successivi hanno portato all’identificazione di un terzo gruppo di proteine OA1 mutanti che, uscite dal Reticolo Endoplasmatico, raggiungono una destinazione post-golgiana, ma non hanno ancora una distribuzione selvatica.

In generale circa il 50% delle mutazioni, individuate nei pazienti OA1, è rappresentato da mutazioni inattivanti/nulle che determinano la mancanza della proteina OA1 o la presenza di una proteina OAI tronca, prontamente degradata nel Reticolo Endoplasmatico, mentre il restante 50% è rappresentato da mutazioni missenso, la maggior parte delle quali ( circa il 60%, corrispondente alle mutazioni del gruppo II) determina la completa mancanza o una rilevante riduzione del prodotto proteico. Di qui l’ovvia conclusione che la perdita del meccanismo di funzione della proteina OA1, associata all’assenza o riduzione della proteina, sia la causa principale dell’Albinismo Oculare, e l’ipotesi, attendibile, che anche le mutazioni del gruppo I abbiano tale ruolo.

Del resto anche l’assenza di una correlazione fenotipo-genotipo, con le principali caratteristiche oculari presenti, con severità confrontabile, in tutti i pazienti OA1, suggerisce che tutte le mutazioni a carico del gene OA1, qualunque sia la loro natura, abbiano un effetto equivalente sulla funzione della proteina OA1.